對蝦白斑綜合癥病毒（White Spot Syndrome Virus，wssv）病是全世界范圍內對養殖對蝦危害最大的病毒病。迄今為止，學者們對引起該病的病毒命名尚不統一，有白斑桿狀病毒（WhiteSpotBac-ulovirus，WSBV）、皮下及造血組織壞死病桿狀病毒（HepodermalandHematopoietieNecroisisBacu-lovirus，HHNBV）、日本對蝦桿狀病毒（Rod-shapednuclearVirusofPenacusJaponicus，RV-PJ）和系統外胚層和中胚層桿狀病毒（SystemicEc- todermal and Mesoderrnal Baculovirus，SEMBV）等。所有這些病毒均被認為屬于桿狀病毒科的無包涵體桿狀病毒亞群。在第六次國際病毒分類會議 （ICTV）報告中取消了以上命名，具體命名待定，按照Lightener的意見將其暫時命名為白斑綜合癥病毒（wssv）。我國自1993年暴發此病以來，每年都發生對蝦大規模毀滅性死亡，幾乎所有養殖蝦類皆可被其感染。WSSV毒力較強，3～10天內被浸染者的累積死亡率達100.0%。世界動物衛生組織（OIE）2000年將其列為“需要作報告的疾病之一”。鑒于WSSV尚未有有效的治療方法，快速準確的病原分離檢測技術已成為研究的焦點之一。本文就對蝦白斑綜合癥病毒（wssv）的檢測技術作一綜述，以供。 1 直接觀察法 直接觀察法是根據養殖過程中對蝦急性和慢性死亡的情況，對照白斑綜合癥的典型癥狀作出判斷。如頭胸甲出現白斑、甲殼變軟易剝離等，這種方法主要是根據實踐經驗判斷，且必須是對蝦感染病毒致死后才能發現。 2 組織化學法與電子顯微鏡技術 組織化學法是取對蝦的各種組織用適當的染色技術在光鏡下進行檢測。主要有H-E染色和T-E染色等。莫照蘭等（2000）曾用H-E染色感染 WSSV病毒的螯蝦的鰓和胃組織，在光鏡下觀察病變組織與對照組呈現差異顯著，組織結構松散殘缺呈壞死狀態。黃傻等首創一種用于現場診斷的T-E染色方法，整個檢測過程只需要10分鐘左右，具有快捷、簡單、方便等優點，但是，這種方法對操作技術要求高，而且由于對蝦可能終生帶毒而不發病，因此，即使檢測到病毒也不能確認一定會發病。相對而言電子顯微鏡觀察更為準確，可直接觀察到病毒的形態和大小。吳友呂等（1995）曾用電鏡在對蝦體內檢測到WSSV。姜明等（1996）對中國對蝦在病害暴發期間病蝦肝胰臟、鰓、腎和腸組織進行固定切片，在透射電鏡蝦觀察到桿狀病毒的3種存在形態。莫照蘭等（2002）對螯蝦人工感染WSSV病毒并取鰓和胃用固定液固定，制成超薄切片在電鏡下觀察到WSSV的病毒粒子。謝數濤等（2000）純化WSSV病毒并負染后在電鏡下觀察發現病毒的精細結構。Nunan等（1998）和Zhan等（1998）也曾對對蝦人工感染WSSV進行了電子顯微鏡觀察。組織化學與電子顯微鏡技術都是在病毒大量增殖后才能觀察到，當感染早期或處于潛伏期病毒量小時，則難以觀察到。 3 免疫學檢測技術 免疫學檢測技術是根據抗原抗體反應建立的，方法多種多樣，主要用于快速鑒定。單克隆抗體和多克隆抗體的制備是進行檢測的必需工作。單克隆抗體技術是隨著雜交瘤細胞建立而發展起來的，可以產生對特異決定簇的特異抗體。優點是制備抗體時抗原不需高度純化、特異性強；缺點是制備繁瑣、試驗條件嚴格、易漏檢。多克隆抗體來源于抗血清，含所有抗原決定簇的抗體，易發生交叉反應，出現假陽性，特異性不強，一般不用于對蝦病毒的檢測。 對蝦病毒的檢測一般采用單克隆抗體，常用酶聯免疫吸附分析（EIJSA）實驗。酶聯免疫吸附分析是目前發展最快的免疫標記技術，具有靈敏、快速、易操作、可定量等優點，應用廣泛。于佳等（1995）將 WSSV病毒注射小鼠，用免疫后的脾細胞與Sp2/O骨髓瘤細胞融合，篩選出了可用于WSSV檢測的單克隆抗體。黃倢等（1995）用單克隆ELISA技術提前20～40天對對蝦發病的可能性做出預報。涂小林等（1995）用純化的對蝦病毒免疫新西蘭兔獲得多克隆抗體，建立了病毒的間接ELlSA檢測技術，可在6小時內完成對樣品的檢測，靈敏度可達60ng水平。史成銀等（1999）認為以脫脂奶粉作封閉劑的快速間接ELISA方法具有大大縮短檢測時間，提高檢測靈敏度降低或消除酶標板“邊緣效應”、降低檢測成本等優點，在對蝦病毒檢測的實驗室研究和生產實踐上都具有廣泛的應用前景。汪岷等（2000）用純化的WSSV免疫新西蘭兔獲得純化的IgG多克隆抗體，建立了雙抗體夾心法直接ELISA檢測方法，6小時左右即可完成檢測。朱建中等（2002）建立了WSSV單抗介導間接ELISA，不僅能快速檢測病毒，還可用于檢測WSSV在對蝦動物模型體內的動態分布，為研究WSSV在螯蝦體內的感染機理提供了手段。高宏等（2002）利用病毒細胞與宿主細胞親和吸附這一特性建立了新的篩選中和抗體的方法，可在缺少細胞系的情況下成功篩選中和抗體。 Ponlos等（1994）制備了對蝦WSSV病毒的 IgM型單克隆抗體，檢測新鮮對蝦時存在非特異性反應，需將新鮮樣品凍存較長一段時間才能消除非特異性反應。Lightner等（1998）用WSSV單克隆抗體進行ELISA檢測對蝦時也出現上述問題。Hameed等（1998）用硝化纖維素酶免疫印跡法（NC-EIB）檢測WSSV感染斑節對蝦，發現在對蝦淋巴、眼柄、鰓、頭部軟組織、腹肌和肝胰臟都存在WSSV。Zhan等（1999）制備了WSSV的單克隆抗體在中國對蝦體內檢測到了WSSV。 4 分子生物學技術 4.1 核酸探針（DNAProbe）技術 核酸探針技術又名基因探針或核酸分子雜交技術，其原理是兩條不同來源的核酸鏈如果具有互補的堿基序列就能夠特異結合成為分子雜交鏈。因此，在已知的DNA片段上加上可識別的標記，成為探針來檢測未知樣品中是否具有與已知序列相同的序列，并判斷其與已知序列的同源程度。核酸探針具有敏感性高（可測出10E-9～10E-12的核酸）、特異性強等優點，易成功地用于多種疾病的診斷。在對蝦 WSSV病毒的檢測上，張巖等（1995）用Pub18構建了對蝦WSSV的DNA重組質粒，提取后經斑點雜交和酶切分析，證明質粒中插入的片段為病毒DNA。劉萍等（1995）從純化的病毒中提取DNA，用限制性內切酶酶切并組裝到Puc18質粒上，建立了WSSVDNA文庫，從中篩選出3個重組質粒，用光敏生物標記成探針檢測染毒對蝦效果很好。石正麗等（1998）從中國對蝦病蝦中分離到一種桿狀病毒，在重組質粒中取2個克隆與WSSV基因片段制成探針檢測我國沿海地區中國對蝦桿狀病毒的同源性。鄧敏等（2000）通過分離純化WSSV部分基因組文庫，將制備的探針進行Southern雜交、打點雜交和原位雜交，結果證明克隆片段對WSSV特異，可用于WSSV檢測。常青山等（2000）從中國對蝦桿狀病毒核酸隨機文庫中篩選出4個片段用地高辛標記作為探針進行斑點雜交檢測對蝦桿狀病毒，實驗表明中國對蝦桿狀病毒存在垂直傳播的可能性。Lo等在檢測野生斑節對蝦WSSV時也發現該病毒存在垂直傳播的可能性。黃燦華等（2000）首先用地高辛標記的WSSV核酸探針動態研究其在對蝦體內的侵染過程，對蝦攝取感染WSSV的食物，經消化道上皮細胞進入蝦體，伴隨淋巴循環進而侵染其它靶組織，直至對蝦發病死亡。呂玲等（2000）用WSSV核酸探針原位雜交（1SH）檢測對蝦，發現對蝦的不同組織對病毒具有特異性，并比較了ISH與H-E兩種檢測方法，結果ISH比H-E染色更準確、敏感。朱建中等（2001）用核酸探針斑點雜交方法研究了WSSV青島株在螯蝦體內的動態分布，表明病毒在對蝦和螯蝦體內感染機理具有相似性。Lo等（1999）、Chang等用此技術檢測WSSV，但不是用PCR擴增基因片段得到核酸探針的。Nunan等和徐洪濤等以從感染對蝦中純化的WSSV為模板進行PCR擴增，然后用DIG標記擴增產物而得到探針。 雷質文等（2001）用PCR成功制備了DIG標記探針，用于檢測對蝦WSSV，證實了白對蝦時WSSV的天然宿主。該法比常規方法快速，特異性、敏感性和可重復性均較高，可作為對蝦暴發病的診斷、抗特定病原對蝦的選育、出入境對蝦及對蝦產品的檢疫方法，目前已制備成試劑盒。宋曉玲等（2001）用DNA斑點雜交檢測對蝦及其飼料和環境生物，發現對蝦主要餌料及環境生物類群均可檢出WSSV，為了解對蝦WSSV的感染途徑提供了依據。莫照蘭等（2002）用地高辛標記的核酸探針檢測WSSV人工感染的淡水克氏原螯蝦，結果表明對蝦WSSV克感染淡水克氏原螯蝦，病毒核酸原位雜交檢測敏感特異。 4.2 PCR技術 聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種可在體內將特異性DNA序列進行高效擴增的技術，與傳統診斷方法相比，它具有敏感性及特異性高，簡單、快速等優點，已廣泛應用于 WSSV的檢測。汪岷等（1998）用臺灣WSSV的引物，對中國對蝦桿狀病毒進行PCR檢測，結果表明中國對蝦桿狀病毒與臺灣WSSV的同源性達98.7%，該PCR引物可用于對蝦桿狀病毒的檢測。劉萍等（1999）采用PCR檢測方法對人工感染親蝦的胃、鰓、卵巢、卵和各期幼體進行跟蹤檢測，認為WSSV難以從卵直接向幼體進行傳播。戰文斌等 （2000）通過PCR技術檢測中國對蝦WSSV，認為存在由親蝦傳播給蝦苗的感染途徑。 （2000）應用PCR技術分別對暴發性流行病發生前、中、后期的對蝦樣品進行檢測，結果表明PCR可快速靈敏準確的檢測WSSV、對病毒的早期診斷和健康對蝦的選育提供依據。謝數濤等（2000）通過對WSSV基因測序設計PCR引物，建立了對蝦WSSV的PCR檢測方法。上海生化所已研制成中國對蝦桿狀病毒 PCR診斷試劑盒，靈敏度達0.125ng，在上海、浙江等地應用時具有特異性。 為使檢測結果更快速更準確，一些學者對PCR技術做了不同改進。呂玲等（2000）用改進的煮沸法提取WSSV病毒DNA，再進行PCR擴增，節省了檢測時間（僅需4小時）且敏感性更高特異性更強，并認為附肢和肌肉是PCR檢測的合適部位。章曉波等（2000）將對蝦WSSV的一段特異性DNA設計成分子信標探針，用于該病毒的PCR檢測，結果顯示分子信標不影響PCR擴增且具有較高的特異性。夏春等（2000）根據對蝦WSSV基因序列設計了4個多重PCR法用引物，建立了多重PCR檢測WSSV的方法，通過優化反應條件，可從陽性感染的中國對蝦fg級DNA中定性檢測WSSV。謝數濤等（2001）利用套式PCR檢測對蝦WSSV，結果顯示其靈敏度大約為一步PCR的10E4倍。龐耀珊等（2003）設計了一對WSSV的特異性引物，建立了快速檢測WSSV的二溫式PCR，最低可檢測到1.0pg的WSSV總DNA，該PCR具有高度特異性和敏感性，可用于WSSV感染初期或潛伏期的親蝦和蝦苗的檢測和環境監測。 綜上所述，對蝦WSSV的檢測技術從最初依靠組織病理學和透射電鏡觀察到免疫學方法、DNA雜交和PCR技術，靈敏度、特異性和重復性都有了很大提高，檢測結果更加快速準確。一般PCR比DNA雜交，熒光標記比酶聯免疫標記靈敏，由于條件限制，PCR常用于實驗室操作，熒光免疫需特殊儀器，因此DNA雜交和酶聯免疫應用較多。為了提高檢測的靈敏度，彌補單一檢測方法的不足，可采用多種方法結合使用。如制備DNA探針時，利用PCR擴增使探針量增加，DNA雜交與ELISA結合使用，再用酶標記探針的方法，PCR技術與DNA雜交結合使用，用DNA雜交檢測PCR產生的結果，熒光標記用于PCR產物的檢測，使結果更直觀�？傊�，隨著檢測方法的不斷改進，對蝦WSSV的檢測將更快速、簡便、靈敏、特異。（ 佚名）