大花蕙蘭(Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｈｙｂｒｉｄｕｍ)采用傳統(tǒng)的分株繁殖,繁殖速度慢、周期長,尤其對國外新引進的優(yōu)良品種,難以迅速占領市場、滿足需求.大花蕙蘭類組培快繁國內公開報道的僅限于虎頭蘭和‘水晶多芭’等個別品種,因其各種、品種間培養(yǎng)有很大差異,對于新品種‘西維亞’、‘瑪利蓮夢露’、‘蒙米拉絲’、‘女皇’的培養(yǎng)國內尚無報道,對大花蕙蘭的系統(tǒng)研究也遠遠跟不上市場的發(fā)展速度,于1998年以新引進的優(yōu)良大花蕙蘭品種為材料,利用組織培養(yǎng)和快速繁殖技術,開展了大規(guī)模工廠化育苗的系統(tǒng)研究,提高了誘導成苗率和繁殖速度,大大降低了成本,使本項技術在市場中更具競爭能力和推廣價值,并繁育出大量種苗,批量供應市場,為大花蕙蘭工廠化育苗提供了科學依據(jù)與參考. 把母株放在溫室內盆栽培養(yǎng),于2月底～4月初陸續(xù)從母株上取8ｃｍ左右的新芽,從基部切離,用自來水沖洗,再用洗潔凈溶液浸泡5ｍｉｎ,自來水沖洗10ｍｉｎ,剝去最外幾層葉片,并剪去芽的上半段.然后在超凈工作臺上采用3步滅菌處理法處理:先在70%的酒精中處理6ｓ,立即投入10%次氯酸鈉溶液中10ｍｉｎ,稍加搖動,取出后用無菌水沖洗,剝去外層2～3片葉;再放入5%的次氯酸鈉溶液5ｍｉｎ,取出后無菌水沖洗,剝至最后一枚葉片;再放入1%的次氯酸鈉溶液1ｍｉｎ,取出后無菌水沖洗數(shù)次.以上次氯酸鈉溶液中均加入Ｔｗｅｅｎ-60以利殺菌劑更有效地發(fā)揮作用.在無菌條件下剝出約5ｍｍ長的莖尖,以生長點為中心,用解剖刀把莖尖切成4個小方塊,分別接入已準備好的培養(yǎng)基上.ｐＨ5.2～5.6,蔗糖2%,瓊脂條0.6%～0.85%,溫度22～25℃,光照強度2000ｌｘ,每日光照12ｈ. 外植體接在附加一定激素配比的培養(yǎng)基上,20ｄ左右外植體周圍出現(xiàn)許多白色顆粒狀愈傷組織,繼續(xù)培養(yǎng)逐漸轉為綠色,25ｄ可形成大量原球莖,以后每隔20ｄ進行一次繼代培養(yǎng),若繼代不及時易形成不定芽,需在繼代時切去,影響原球莖增殖,造成浪費.繼代前觀察統(tǒng)計試驗結果.大花蕙蘭對ＫＴ的敏感程度高于對6ＢＡ的敏感程度,相同濃度的ＮＡＡ下,ＫＴ用量稍微增減即會產生明顯差異,低濃度的ＫＴ對原球莖增殖有明顯促進作用,高于0.1ｍｇＬ則會抑制其生長.最佳激素配比為ＫＴ0.05ｍｇ/Ｌ,ＮＡＡ0.5ｍｇ/Ｌ。 隨機分切法雖操作快捷,但有大量切割過于碎小的培養(yǎng)塊死亡;縱切法操作需細致、費時,但原球莖增殖數(shù)多,大小一致;碾壓和井字型切割(底部不分開)原球莖增殖時間可縮短、可加快繼代,但單個繼代原球莖增殖倍數(shù)減少. 通過前期初步篩選后,選擇以附加ＫＴ0.05ｍｇＬ,ＮＡＡ0.5ｍｇＬ的最佳激素配比,把原球莖切塊分別接種ＭＳ,12ＭＳ,ＶＷ,ＫＣ為基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上,測試不同培養(yǎng)基種類對原球莖增殖的影響.結果表明:ＭＳ,1/2ＭＳ,ＶＷ,ＫＣ均可應用于原球莖增殖,但以ＫＣ效果最佳.ＭＳ,1/2ＭＳ,ＶＷ也能分化和增殖原球莖,但增殖緩慢、色淡.附加香蕉泥對原球莖增殖有明顯促進作用,使增殖倍數(shù)提高到4.22,且生長健壯,色澤深綠。 用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)最差,增殖速度慢,且易導致原球莖塊死亡,繼代不及時易分化出芽,但適合芽和根的分化培養(yǎng);液體培養(yǎng)增殖較快,但生長不夠健壯,色黃綠,質地較疏松;半固體培養(yǎng)基(減少瓊脂用量)最佳,原球莖增殖量大,色深綠,健壯.,每隔4～5ｄ對半固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶震蕩,搖動一次,生長增殖效果更好。 生長健壯的原球莖不切割接種在固體分化培養(yǎng)基上,10～15ｄ可誘導出叢生芽,繼續(xù)培養(yǎng)30ｄ左右可發(fā)育成小苗,當培養(yǎng)瓶內叢生芽長出5ｃｍ左右時,將苗與新增殖的原球莖分開,原球莖繼續(xù)增殖培養(yǎng),苗轉入生根壯苗培養(yǎng)基中,每瓶8～10個小苗,當苗長出5～6片葉,根長到3ｃｍ左右時,即可開蓋于溫室內煉苗.通過添加不同水平的ＮＡＡ比較,以ＮＡＡ0.2ｍｇ/Ｌ為最佳。 煉苗2ｄ后即可將苗取出,用清水洗凈根部的瓊脂,植于溫室苗床內,栽培基質為松針+苔蘚+粗砂,苗床底部墊以碎石、碎磚塊,用稀薄的營養(yǎng)液噴霧,每隔1周噴1次800倍的多菌靈溶液,溫度保持在10～25℃,在大棚里亦可生長良好,1個月后統(tǒng)計移栽成活率可達98%以上.1年后上盆,栽培基質用泥炭土+蕨根+樹皮,每周澆1次液肥. 分析討論 (1)大花蕙蘭屬熱帶氣生蘭,靠根系附著在林中樹木及巖石上生長,多數(shù)種類有內生菌共生.因此,外植體滅菌采用3步處理.據(jù)筆者經驗,大花蕙蘭外植體滅菌比其它植物有一定難度.我們曾采用抗生素處理,效果不佳.對于供試品種是否由于存在內生菌而引起外植體滅菌處理困難,以及內生菌在植物體內的分布傳播情況有待進一步研究. (2)培養(yǎng)基添加香蕉泥對大花蕙蘭增殖和分化有明顯的促進作用,這與香蕉泥中的有機質和天然激素有關,同時能使培養(yǎng)物在適宜的酸性條件下生長. (3)培養(yǎng)過程中,不同品種增殖、成苗及幼苗分生情況有一定差異.其中‘夢露’明顯比其它品種增殖快且易分生子苗,‘索菲亞’增殖最慢,很少分生子苗,這可能與品種固有特性有關. (4)原球莖切塊細小、稀疏的培養(yǎng)瓶內,群體生長較慢,而切塊較大且密集的瓶內,生長十分健壯,表現(xiàn)類似于群體生長效應.因此切割時不可過細,直徑要在2ｍｍ以上,每瓶可接種30多個培養(yǎng)塊,可使瓶內營養(yǎng)得以充分利用. (5)接種時,采用大罐頭瓶把培養(yǎng)塊1次夾入或鏟入,稍加晃動半固體培養(yǎng)基即可使培養(yǎng)塊分散開來,既節(jié)約時間、成本,又降低了污染率. (6)用改良ＫＣ(無機鹽減半)培養(yǎng)大花蕙蘭,無機鹽用量比其它報道用ＭＳ培養(yǎng)基大大減少,增殖分化效果均佳.采用降低瓊脂用量制成半固體培養(yǎng)基可簡化接種步驟,而且培養(yǎng)塊浸在培養(yǎng)基內,降低了培養(yǎng)塊黃枯和切口褐化的機會.定期搖動培養(yǎng)瓶,能使培養(yǎng)瓶內營養(yǎng)得以充分利用.無機鹽和瓊脂在培養(yǎng)成本中占有很高的比例,采用以上技術可大大節(jié)約成本,利于大規(guī)模生產應用. (7)生產過程中,用自來水代替蒸餾水,用綿白糖代替蔗糖,用廉價的瓊脂條代替瓊脂粉,降低了成本,效果沒有絲毫降低.由于大花蕙蘭原球莖增殖不必用小容器和相對較高的罐頭瓶,可用透光性好的大容器代替. (8)采用1次定植,不經移栽,可以減少對幼苗根系的損傷和節(jié)約人力.只要保證溫室內相對濕度,對成活率無顯著影響,但組培苗前期生長緩慢.根據(jù)趙楊景對3種內生菌與大花蕙蘭共生對礦質營養(yǎng)吸收影響的研究,內生菌對吸收礦質營養(yǎng)、促進幼苗生長有明顯的作用.（ 佚名）